Die südliche Begrenzung des Spreewaldes ist der Lausitzer Grenzwall, der jedoch vom Spreewald nur ganz allmählich zu seinen weiter südlich gelegenen Haupthöhen ansteigt. Im Norden bildet der Übergang auf die trockene Lieberoser Heide eine markante Landschaftsgrenze. Die östliche und westliche Grenze des Oberspreewaldes ist etwas unscharf, da sich dort das Baruther Urstromtal jeweils fortsetzt. Der Tagebau Cottbus Nord bildet heute die künstlich geschaffene Ostgrenze. Im Unterspreewald bilden die Krausnicker Berge im Westen und der Marienberg im Osten weithin sichtbare Landmarken für die Begrenzung. Anders als im Oberspreewald füllt der kleinere Unterspreewald die Niederung hier aber nicht komplett aus und ist auf den westlichen Teil beschränkt. Allgemein wird der Neuendorfer See als Nordgrenze des Spreewaldes angenommen. Die Flusslaufverzeigung endet jedoch erst einige Kilometer östlich mit der Einmündung der Pretschener Spree in die Hauptspree.

Als deutlich schwerer erweist sich die Abgrenzung des Spreewaldes aus heutiger touristischer und wirtschaftlicher Sicht. Auf Grund seiner Bekanntheit und des damit verbundenen Vorteils entfernten sich die Grenzen des Tourismus- oder Wirtschaftsgebietes Spreewald zunehmend vom eigentlichen Naturraum Spreewald. Vor allem für die regionale Nahrungsmittelindustrie wurde der Wirtschaftraum Spreewald geschaffen, der deutlich größer als der eigentliche Spreewald ist. Dieser Wirtschaftsraum ist als geographische Angabe innerhalb der EU geschützt. Vor der Unterschutzstellung des Raumes kam es mehrmals zu gerichtlichen Auseinandersetzungen über die Bezeichnung Spreewald auf Lebensmitteln. Gewisse Bekanntheit erreichte der sogenannte Gurkenkrieg.